摘要

　　髓母细胞瘤是一种主要发病于儿童小脑附近的恶性脑肿瘤。近年来，与肿瘤细胞的基因表达模式相配合对髓母细胞瘤采用化疗的方法已经取得了效果。但是，普遍认为原癌基因MYC已发生基因扩增或高表达的髓母细胞瘤预后极差，化疗效果不佳。因此，迫切需要一种切实有效的新药治疗人MYC亚型髓母细胞瘤，为此建立动物疾病模型的环节被提上日程。此次，笔者展示了世界首个反映人MYC亚型髓母细胞瘤性质的新型髓母细胞瘤小鼠模型。具体而言，从缺损肿瘤抑制基因——Trp53基因的小鼠的小脑内采集小脑前体细胞，载入Myc基因后立即将小脑前体细胞移植入免疫缺陷小鼠的脑内，以此使它产生脑肿瘤。这种肿瘤从病理学上分析，由人MYC亚型髓母细胞瘤中观察到的大细胞性或逆行性细胞组成，它的基因表达模式及对SHH信号通路抑制剂的应答性比之前公布的小鼠模型都更接近人MYC亚型髓母细胞瘤。不久的将来，这种小鼠模型将为确立人MYC亚型髓母细胞瘤的疗法发挥莫大的作用。

　　前言

　　髓母细胞瘤是发生于小脑的一种恶性肿瘤，是仅次于星形细胞瘤(astrocytoma)的第2大儿童脑肿瘤。北美每年约有400名儿童被确诊患有髓母细胞瘤。通过外科手术联合放化疗的方法，目前50%以上的患者的预后良好。同时也有报告称，有些患者患有恶性程度极高的髓母细胞瘤，按目前的疗法治疗后几乎未显现出任何效果。为了揭示为什么同是髓母细胞瘤，而预后会出现如此大的差异，最近几年，相关机构在髓母细胞瘤患者的通力合作下开展了大规模基因分析工程，结果发现，如果依据基因表达模式分类，髓母细胞瘤至少有四个亚型。最初的两个亚型由控制细胞增殖的WNT信号或SHH信号过度表达形成。WNT亚型髓母细胞瘤的预后很好，几乎所有的患者都能治愈;但是SHH亚型髓母细胞瘤位于SHH信号下游的转录因子Gli1处于激活状态，诱导MYCN基因等细胞分裂促进基因的表达。这种亚型比WNT亚型的预后差很多，但是在众多的基础研究的支撑下，髓母细胞瘤小鼠模型得以最终确立，利用这种模型进行药物筛选后，目前正在开发GDC-0449等对人体有效的治疗药物。第3种亚型是MYC亚型髓母细胞瘤。这种亚型的特点是MYC已发生基因扩增或高表达，预后极差，目前还没有指定有效的治疗药物。最后一种亚型的致病基因尚不明确，人们对这种亚型知之甚少，但是由于它的预后甚至比SHH亚型更差，故需今后更多的研究解决此课题。

　　为辅助确立针对髓母细胞瘤的有效疗法，至今已经制作了多种髓母细胞瘤小鼠模型。由于SHH信号抑制受体PTCH1的基因发生突变的Gorlin综合症患者被发现患有髓母细胞瘤，故使用Ptch1基因剔除小鼠制作了髓母细胞瘤小鼠模型。目前，大部分模型的做法是在公认为髓母细胞瘤起源细胞的小脑颗粒细胞上激活SHH信号。至今为止，几乎所有的髓母细胞瘤小鼠模型都反映了人SHH亚型髓母细胞瘤，而最近笔者的团队成功制作出全球首个WNT亚型髓母细胞瘤小鼠模型。令人惊异的是，我们的团队发现WNT亚型髓母细胞瘤的起源细胞并不是小脑颗粒细胞，而是位于后脑勺下部的细胞。也即，发生于小脑的不同亚型的髓母细胞瘤是由于不同的细胞产生的不同的基因异常，这样造成不同类型的肿瘤。

　　但是，关于剩下的两个亚型依然没有确立反映人髓母细胞瘤性质的小鼠模型，如此一来确立合理的疗法也就姗姗来迟。此次研究中，我们的研究小组致力于建立第三种亚型——MYC亚型髓母细胞瘤的小鼠模型，以此推动这种难治性肿瘤的研究进程。

　　1、Trp53基因剔除小鼠的小脑神经前体细胞中Myc基因的强制表达造成大细胞性或逆行性脑肿瘤

　　目前很多研究都在探讨Myc与脑肿瘤的发病是否存在关联。此前有报告表示，单纯将Myc载入小鼠的小脑神经前体细胞后并不会使小鼠出现脑肿瘤，基于此，我们做了一个推论：或许是Myc在肿瘤抑制基因缺损的情况下仍然在发挥功能，诱导小脑出现脑肿瘤。普遍认为MYC等肿瘤基因的过剩表达造成DNA复制压力，而一旦出现DNA损伤，MYC就会通过ATM和ATR造成细胞死亡。因此，在诱导这些细胞死亡的肿瘤抑制基因——TP53基因(小鼠为Trp53基因)缺损的情况下，我们利用小脑细胞研究了MYC的致瘤性。

　　具体地说，使用密度梯度离心法从Trp53基因剔除小鼠的新生幼鼠的小脑中分离出小脑颗粒细胞，通过反转录病毒培养，导入Myc基因后立即将小脑颗粒细胞植入免疫缺陷小鼠的脑内。笔者之前的研究发现，采用同样的方法使Myc基因过度表达，这种过度表达会导致SHH亚型髓母细胞瘤(小鼠Mycn髓母细胞瘤)，因此此次笔者的团队将Mycn基因作为阳性对照。令人意想不到的是，Myc形成肿瘤的速度比Mycn更快，从病理学上分析两者也呈现不同的细胞形态。而且，与SHH亚型髓母细胞瘤和WNT亚型髓母细胞瘤小鼠模型的肿瘤组织相比，可确认Myc诱导的肿瘤(小鼠Mycn髓母细胞瘤)的细胞体积增大，并且TUNEL阳性细胞明显增多。这种表达类型与人MYC亚型髓母细胞瘤中观察到的大细胞性或逆行性脑肿瘤极其相似。

　　2、小鼠Myc髓母细胞瘤显示出与人MYC亚型髓母细胞瘤类似的基因表达模式

　　根据小鼠Myc髓母细胞瘤和小鼠Mycn髓母细胞瘤的不同病理学表达模式，我们对肿瘤组织中表达的基因进行了研究。除了小鼠Myc髓母细胞瘤和小鼠Mycn髓母细胞瘤，还从WNT亚型的小鼠模型和SHH亚型的小鼠模型采集了肿瘤样本，进行大规模微阵列分析，结果发现小鼠Myc髓母细胞瘤的基因表达模式与别的肿瘤的表达模式完全不同。尤其是小鼠Myc髓母细胞瘤的干细胞标志物——Prom1基因和Lgr5基因、人MYC亚型髓母细胞瘤的典型肿瘤标志物——Npr3基因的表达水平有所提升。另外，我们以我们的研究机构拥有的髓母细胞瘤基因分析数据为基础，运用我们自行开发的AGDEX法对小鼠Myc髓母细胞瘤的基因表达模式与人体标本的表达模式进行比对，发现小鼠Myc髓母细胞瘤很好地再现了人MYC亚型髓母细胞瘤的模式。

　　3、小鼠Myc髓母细胞瘤的发病原因可能是小脑神经前体细胞的性状变化

　　确定髓母细胞瘤的病源细胞是研究肿瘤细胞性质的重要手段。笔者认为小鼠Myc髓母细胞瘤的病源细胞可能是小脑颗粒细胞，然后通过GFP标识小脑颗粒细胞，使用细胞分类器

　　从已做标识的Trp53基因剔除小鼠脑内分离出GFP阳性小脑颗粒细胞和GFP阴性小脑细胞，接着分别导入Myc基因，尝试诱导小鼠Myc髓母细胞瘤。试验结果发现，GFP阳性和GFP阴性两种细胞均可以诱导出拥有同一种基因表达模式的小鼠Myc髓母细胞瘤。另外，小鼠Myc髓母细胞瘤的基因表达模式与GFP阳性和GFP阴性两种细胞最初的基因表达模式完全不同。试验结果表明，Trp53基因缺损的小鼠的小脑颗粒细胞和非小脑颗粒细胞受Myc影响发生性状改变，或可进展成为Myc髓母细胞瘤。

　　4、小鼠Myc髓母细胞瘤的肿瘤传导细胞在培养时产生neurosphere并发生增殖

　　Myc亚型髓母细胞瘤之所以恶性程度极高，是因为它的肿瘤传导细胞与别的亚型相比数量更多，或者也可能因为它的性质不一样。因此，将来源于SHH亚型髓母细胞瘤的小鼠模型及小鼠Myc髓母细胞瘤的肿瘤细胞进行极限浓度稀释后移植入免疫缺陷小鼠脑内，研究其致瘤性。结果发现，要使来源于SHH亚型髓母细胞瘤的肿瘤细胞形成肿瘤，需要植入超过200万个细胞，但如果采用来源于小鼠Myc髓母细胞瘤的Myc亚型肿瘤细胞，只需植入100便足矣。通过这个试验可知，Myc亚型髓母细胞瘤含有的肿瘤传导细胞比例比SHH亚型髓母细胞瘤多得多。

　　有些肿瘤传导细胞拥有干细胞样细胞的特点。实际上，用于培养神经干细胞的neurosphere的培养条件中，确认来源于小鼠Myc髓母细胞瘤的肿瘤细胞可以产生neurosphere，并发生增殖。培养中的肿瘤neurosphere表达了Sox2和Nestin等多种神经干细胞标志物。另一方面，由于来源于SHH亚型髓母细胞瘤小鼠模型的肿瘤细胞在同样的培养条件下并未发生增殖，由此可知两种不同亚型的肿瘤细胞的特性，尤其是在可增殖环境下的特性迥然不同。而且，将小鼠Myc髓母细胞瘤植入免疫缺陷小鼠的脑内后，来源于小鼠Myc髓母细胞瘤的neurosphere细胞再次形成肿瘤，无论是病理学上或是基因表达模式上均保持了小鼠Myc髓母细胞瘤的性质。这个结果显示，来源于小鼠Myc髓母细胞瘤的neurosphere细胞是肿瘤传导细胞。

　　5、小鼠Myc髓母细胞瘤对SHH信号通路抑制剂具有抵抗性

　　众所周知，利用激活SHH信号的受体Smoothened的功能抑制剂——环杷明和GDC-0449 ，可以有效地使SHH亚型髓母细胞瘤的增殖受到抑制。另外，笔者最近开展的研究证实，在来源于SHH亚型髓母细胞瘤的肿瘤细胞中，一旦激活BMP信号，则会造成肿瘤细胞的分化。因此我们对来源于SHH亚型髓母细胞瘤的肿瘤细胞进行贴壁培养，然后立即添加环杷明和BMP4分析其对细胞增殖产生的影响。结果发现，来源于SHH亚型髓母细胞瘤的小鼠模型的肿瘤细胞的增殖明显受到抑制，但是来源于小鼠Myc髓母细胞瘤的肿瘤细胞上几乎未显现任何细胞增殖抑制效果。进而，为了观察对小鼠Myc髓母细胞瘤的肿瘤传导细胞的效果，在neurosphere培养条件中的肿瘤neurosphere内加入环杷明和BMP4，结果与上述做法出现一致结果，即肿瘤的增殖没有受到抑制。以上这些结果与人Myc髓母细胞瘤的耐药性相同。从对药物的不同反应可以分析，此次确认的髓母细胞瘤小鼠模型与此前的髓母细胞瘤小鼠模型性质不同。

　　结语

　　这次制作的新型髓母细胞瘤小鼠模型在多个方面都反应了人体髓母细胞瘤的特性。同时，关于这种肿瘤的肿瘤传导细胞的认知依然不够，但是全面认识肿瘤传导细胞在治疗肿瘤方面又是不可或缺的重要一环。例如，有必要确定Myc亚型髓母细胞瘤的肿瘤组织中肿瘤传导细胞的标志物，同时还应确认不形成肿瘤neurosphere的肿瘤细胞是否也不会成为肿瘤传导细胞。另外，我们的研究认为小鼠Myc髓母细胞瘤的病源细胞之一是小脑颗粒细胞，但是通过细胞分类器进行的细胞分离并不彻底，至今未获得准确的研究结果。现在，我们利用Cre-LoxP重组酶系统制作在小脑神经元处特异性诱导Myc的小鼠模型，通过这个方法肿瘤的病源细胞已经确定，而且在肿瘤增殖的微环境方面，也有望建立近似于人髓母细胞瘤的Myc亚型髓母细胞瘤。

　　如今，笔者的研究机构已经借助Myc亚型髓母细胞瘤开展药物筛查工程，我们在不断取得成果，但是实际运用到临床尚需时日。尽管如此，我们也殷切希望这次的研究能为治疗难治性髓母细胞瘤打开一扇窗。